Les puces à ADN
Définition :
Un grand nombre de fragments d'ADN sont fixés sur un support solide, on va hybrider ces fragments d'ADN fixés sur la puce avec une population d'acides nucléiques marqués. Sur la puce on peut définir une unité d'hybridation comme un spot.
Chaque spot correspond au dépôt d'un fragment d'ADN de séquence connue, en quantité donnée et en un point précis (un même ADN est souvent déposé en deux spots pour faire une répétition).
Les ADNs fixés sur la puce s'appellent des sondes, l'avantage des puces c'est qu'on peut réaliser l'hybridation de milliers de sondes vis à vis d'une population choisie d'acides nucléiques.
Alors que dans les expériences précédemment décrites (Southern blot, Northern blot), on hybridait la population d'acides nucléiques avec UNE sonde marquée.
Fabrication et types de puce : macroarrays, microarrays et puces à oligonucléotides
Dans les macroarrays, on a une densité de fragments d'ADN d'environ 25 spots/cm2 et les dépôts se font sur une membrane de nylon (photo de gauche), pour les microarrays la densité du dépôt est plus élevée (1000 ADN/cm2) et il se fait sur une lame de verre (photo du centre). Les ADN sont des fragments amplifiés dont la taille varie entre 200 et 2000 pb mais peuvent aussi être des oligonucléotides de 50 à 70 pb. Les puces à oligonucléotides représentent la miniaturisation la plus poussée (300 000 oligonucléotides/cm2) dans ce cas la taille des oligonucléotides est d'environ 25 pb.
Différents supports peuvent être utilisés (nylon, verre) ainsi que différentes techniques pour déposer les acides nucléiques sur la puce. Le dépôt de l'acide nucléique peut se faire après synthèse ou bien on réalise une synthèse in situ par photolithographie.
La phase d'hybridation est réalisée dans un incubateur et est suivie d'un lavage destiné à débarrasser la puce des cibles nucléiques non hybridées.
Nature et choix des ADN déposés sur la puce : ceci dépend de l'utilisation de la puce
Dans le cas des ADN déposés physiquement on peut utiliser différents types d'ADN :
des fragments de gènes, des oligonucléotides par exemple, plusieurs ADN correspondant à différentes régions peuvent être déposés pour le même gène ;
des amplifiats obtenus avec des amorces très dégénérées et qui contiendront une bonne partie du génome ;
des EST (Expressed Short Tags) : petits fragments de gènes identifiés par une ORF. Ces fragments ont été obtenus à partir d'une banque d'ADNc .
etc.
Utilisation des puces
Les utilisations sont multiples : analyse de l'expression de gènes, détection et caractérisation d'espèces, recherche de mutations...
Mesure de l'expression de gènes
Dans le cours est illustrée l'utilisation d'une même puce à ADN pour hybrider deux populations d'ADNc marqués différemment, le but est de comparer le profil d'expression des gènes (dont les sondes sont sur la puce) dans les deux conditions expérimentales.
« Remarque : »
http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/microarray/ est un site internet où on peut trouver une animation sur la création et l'utilisation d'une puce à ADN pour comparer le profil d'expression d'une cellule saine et d'une cellule cancéreuse. Vous pouvez consulter ce site, il met bien en évidence les différents détails de l'élaboration de la puce, en passant par la préparation des ADNc cibles jusqu'à l'analyse des spots de la puce et la signification biologique de ces spots (un bémol, cependant, le déroulement de l'ensemble de la séquence est un peu lent et le bruitage désagréable).
Les SNP (Single Nucleotide Polymorphism) sont des variabilités ponctuelles de la séquence d'ADN. Les SNP constituent la forme la plus abondante de variations génétiques dans le génome humain. Ils représentent plus de 90% de toutes les différences entre individus. Ici, seules deux formes de sondes ont été représentées : TCGGAG ou TCAGAG. Le sujet qui a fourni l'ADN ne porte que la forme G et pas A, il est homozygote G/G pour ce marqueur. |  Représentation schématique d'une portion de puce à ADN. L'ADN analysé est marqué par un fluorochrome. |
Détection d'agents pathogènes
Des fragments représentatifs du génome des organismes pathogènes à détecter sont placés sur la puce, et ensuite on réalise un marquage des acides nucléiques cibles issus d'une plante infectée par exemple. Une puce a ainsi été réalisée pour pouvoir détecter 44 virus connus pour infecter la vigne. Les sondes correspondent à la fois à des régions conservées (échelle du genre) et à des séquences spécifiques (échelle de l'espèce).
On peut définir la sensibilité d'une puce (jusqu'à quel seuil d'acides nucléiques la puce donne une réponse positive) et sa spécificité. Ceci fait l'objet d'exercices de TD présentés dans le livret, par exemple l'exercice 9.
