Température d'hybridation des amorces
Attention :
La température d'hybridation des amorces avec la matrice est déterminante. Elle conditionne l'existence et la spécificité de l'amplification de l'ADN.
Comment calculer la température d'hybridation des amorces ?
- Si la température d'hybridation est trop élevée, les amorces ne s'hybrideront pas avec la matrice et la synthèse d'ADN ne pourra pas s'enclencher.
- Si la température d'hybridation est trop basse, les amorces risquent de s'hybrider non seulement à la position choisie mais aussi de manière non spécifique avec d'autres régions d'ADN de séquence proche de celle qui a été sélectionnée. On risque alors une amplification de fragments d'ADN autres que celui qui intéresse l'expérimentateur.
La détermination de la température d'hybridation des amorces avec la matrice est donc cruciale.
Méthode :
Une formule, simplifiée à outrance, du calcul de la température optimale d'hybridation d'une amorce est, en degrés Celsius :
Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T) – 4
où G, C, A et T sont respectivement les nombres de bases G, C, A et T composant l'amorce.
Ainsi, pour une amorce qui contiendrait 5 fois chacune des bases, la température optimale d'hybridation serait :
Tm = 4 x 10 + 2 x 10 – 4 = 56°C
